[CGT CDMO의 이해⑧]
바이럴 벡터 생산에 필요한 분석법

미국 텍사스에 있는 CGT CDMO 전문기업 마티카 바이오테크놀로지(이하 마티카 바이오)가 공개한 백서(White Paper)를 기반으로 세포∙유전자치료제 CDMO의 구조와 기능을 알아보는 [CGT CDMO의 이해] 칼럼을 8편 연재합니다.
8편에서는 바이럴 벡터(Viral Vector) 생산에 필요한 분석 방법 개발에 대해 알아보겠습니다. 이번 칼럼을 끝으로 [CDMO의 이해] 연재를 마칩니다.
환자에게 안전하게 사용할 수 있는 높은 품질의 바이럴 벡터를 균일하게 생산할 수 있어야 성공적으로 바이럴 벡터를 생산했다고 말할 수 있다.
세포·유전자치료제는 개발 및 제조 공정이 표준화돼 있지 않고, 다양한 종류의 치료제를 소량 생산하는 것이 특징이다. 어떤 바이럴 벡터나 세포주를 사용하는지에 따라 개발 및 생산공정이 달라질 수 있다.
바이럴 벡터 생산의 주요 공정 변수가 적합한 수치로 유지되는지 실시간으로 모니터링하고 제어해야 일관된 품질의 바이럴 벡터를 생산할 수 있다. 이는 생산공정의 리스크를 최소화하고, 공정 성능을 최적화해 생산 효율을 높이는데 도움을 준다.
바이럴 벡터 생산에 필요한 분석법을 개발하기 위해서 고려해야 할 사항을 알아보자.
중요 품질 속성(Critical Quality Attributes, CQAs)
CQA는 의약품의 품질을 보장하기 위한 물리적, 생물학적, 화학적, 미생물학적 특성이 적절한 범위에 있는 것을 말한다. 바이럴 벡터는 치료에 필요한 유전 물질을 전달하는 역할을 하며, CQA가 잘 설정되어야 바이럴 벡터 제품의 일관성과 안정성을 보장할 수 있다. CQA는 의약품 및 바이럴 벡터의 종류에 따라 다르게 설정되어야 한다. 바이럴 벡터의 효과는 전달되는 유전자와 혈청형에 따라 달라지기 때문에, 유전자 치료에서 CQA는 매우 다양하게 나타난다.
CQA 기준은 치료 효과와 관련해 설정돼야 하며, 효능과 안전성은 개발 초기 단계에서부터 엄격한 기준을 세워야 한다.
각 바이럴 벡터 제품에 대해 설정해야 할 5가지 중요한 CQA는 ▲동일성 ▲효능 ▲순도 ▲안전성 ▲안정성이다. 이를 평가하기 위한 다양한 방법이 있으며, 적절한 분석 기술을 선택할 때는 바이럴 벡터의 특성을 잘 고려해야 한다.
동일성(Identity)
동일성은 생산된 바이럴 벡터가 실제로 의도한대로 생산됐는지, 치료 효과나 환자 안전에 영향을 줄 수 있는 오염이나 유전적 변이가 없는지 확인하는 것이다.
게놈분석과 프로테오믹 분석을 통해 바이럴 벡터의 동일성을 확인할 수 있다.
게놈분석(Genomic Assays of Identity)
게놈 분석은 바이럴 벡터의 DNA나 RNA를 검사해 특정 유전 서열을 분석한다. 이 과정에서 바이럴 벡터의 유전적 무결성을 보장하고, 변이가 있을 경우 철저히 조사해야 한다. 일반적으로 유전자 시퀀싱이나 PCR 분석 방법으로 한다.

프로테오믹 분석 (Proteomic Assays of Identity)
프로테오믹 분석은 바이럴 벡터의 단백질을 분석해 정체성을 확인하는 방법이다. 질량 분석법이나 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assays)와 같은 기법을 사용해 높은 민감도와 정확성을 제공한다. 하지만 유전적 안정성을 평가하는 데는 게놈분석 방법이 더 효과적이다.
효능(Potency)
효능은 바이럴 벡터가 치료적 유전자를 전달하고 발현하는 능력을 평가한다. 물리적 역가와 기능적 역가로 나누어 측정한다.
물리적 역가 (Physical Titer)
물리적 역가는 바이러스 입자의 양을 측정하며, ELISA나 HPLC(High performance liquid chromatography)와 같은 기술로 분석한다. 이는 바이러스 입자의 농도를 확인하는 방법이다.
기능적 역가 (Functional Titer)
기능적 역가는 바이럴 벡터가 의도한 생물학적 기능을 수행하는 능력을 평가한다. 이 방법은 치료 효과를 직접 확인하는 데 사용되며, 흐름 세포 분석법이나 형광 현미경으로 측정할 수 있다.
순도(Purity)
순도는 바이럴 벡터 제품에 오염 물질이나 불순물이 없는 정도를 평가한다. 이는 바이럴 벡터 기반 치료법의 안전성, 효능 및 규정 준수에 필수적이다. 순도 평가는 공정과 수확 과정에서 발생할 수 있는 불순물을 특성화하고 정량화하는 데 중요하다.

일반적인 불순물은 다음과 같다.
숙주 세포 단백질(Host Cell Proteins)
HCP는 바이러스 입자를 생산하는 데 사용되는 제조 숙주 세포에서 유래되며 일반적으로 ELISA 및 질량분석을 사용하여 특성화 및 정량화한다.
숙주세포의 DNA와 RNA(Host Cell DNA & RNA)
제조 과정에서 남은 잔류 숙주 세포 핵산은 일반적으로 qPCR 및 RT‑qPCR을 사용하여 정량화한다.
배양배지 구성물질(Media Components)
혈청 단백질, 항생제, 성장 인자와 같은 배양배지의 구성요소는 단백질 정량 분석이나 액체 크로마토그래피를 사용해 식별한다.
잔류 용매와 화학물질(Residual Solvents& Chemicals)
제조 공정에서 남은 잔류물들은 규정 준수 및 제품 안전을 위해 모니터링해야 한다. 이러한 잔류물은 HPLC를 통해 평가할 수 있다.
응집물와 입자(Aggregates and Particles)
크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)나 동적 광산란(dynamic light scattering)과 같은 분석 기술을 사용하면 응집물과 입자의 존재를 평가할 수 있다.
안전성(Safety)
바이럴 벡터 제품의 안전성을 보장하기 위해서는 오염 물질이나 외부 물질과 관련된 위험을 탐지하기 위한 철저한 테스트와 분석이 필요하다.

안전성 평가는 다음과 같은 몇 가지 중요한 요소를 포함한다.
무균성 (Sterility)
모든 의약품에서 가장 기본적인 요구 사항으로, 바이럴 벡터 제품에는 박테리아나 곰팡이와 같은 미생물이 없어야 한다. 무균 테스트는 주로 미생물 배양 방법을 사용한다.
엔도톡신 (Endotoxins)
엔도톡신은 그람 음성 박테리아(gram-native bacteria)의 세포벽에서 나오는 독성 성분이다. 낮은 수준의 엔도톡신도 심각한 면역 반응을 유발할 수 있으므로, 이를 검출하고 정량화하는 것이 중요하다. 일반적으로 리물루스 아메보사이트 용해물(LAL) 검사로 검출한다.
마이코플라스마 (Mycoplasma)
마이코플라스마는 스스로 복제할 수 있는 박테리아로, 바이럴 벡터 생산 과정에서 오염을 일으킬 수 있다. PCR 검사와 배양 방법으로 이 오염을 감지한다.
복제 가능한 바이러스 (Replication Competent Viruses)
RCV는 치료 과정에서 생성되거나 도입될 수 있는 바이러스로, 인간 세포에서 복제될 수 있어 감염의 위험이 있다. PCR 기반 방법과 세포 배양 분석으로 RCV의 존재를 확인한다.
외래성 오염(Adventitious Agents)
다른 바이러스, 박테리아 또는 세포가 바이럴 벡터 제품을 오염시킬 수 있다. 이러한 물질의 존재를 확인하기 위해 PCR, 세포 배양, 시퀀싱 등의 검사를 한다.
안정성(Stability)
바이럴 벡터의 안정성은 제품의 품질을 보장하고 배치 간 일관성을 유지하는 데 중요하다. 안정성 평가는 다음과 같은 요소를 포함한다.
산도 (pH)
바이럴 벡터의 기능을 유지하려면 적절한 pH 수준을 유지해야 한다. pH가 변하면 바이럴 벡터의 성분이 변질될 수 있다. 그래서 바이럴 벡터를 생산할 때 pH를 지속적으로 모니터링하는 것이 중요하다.
삼투압 (Osmolality)
삼투압은 용액 내 용질의 농도를 나타낸다. 높은 삼투압은 세포를 파괴해 바이럴 벡터의 생산량을 줄일 수 있다. 삼투압을 적정 범위 내에서 유지하는 것이 중요하다.
응집 (Aggregation)
응집은 여러 입자가 결합하여 덩어리를 형성하는 현상이다. 바이럴 벡터의 응집 정도를 감지하고 정량화하기 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 동적 광산란(DLS), 분석 초원심분리(AUC) 등의 방법을 사용한다.

